南京农业大学：ALA上调PpWRKY18提高油桃雌蕊抗冻能力

01研究背景

包括桃树在内的大部分落叶果树的花期都在每年3月中旬至4月中旬。此时气温逐渐回升，但并不稳定，时常乍暖还寒。北方冷空气突然南下，倒春寒危害时有发生，极易引起花果的晚霜冻害。冬季休眠期的桃树可以耐-25~-23℃低温。脱休眠后，则耐寒性下降，尤其是花器官，对低温极其敏感。开放的桃花在-2℃下4小时，其雌蕊将出现严重冻害，导致减产甚至绝产，严重影响果树生产和农民收益。如何减少倒春寒引起的桃花雌蕊冻害具有重要理论价值和生产实践意义。

早已研究发现，5-氨基乙酸丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）能够提高植物耐冷性。在桃树上，它能提高叶片忍受-6℃低温对光合作用能力的影响，促进可溶性糖、脯氨酸以及可溶性蛋白质等渗透调节物质的积累，提高抗氧化酶活性，减少活性氧损伤，显著减轻桃树叶片受到的冻害。但ALA是否能够提高桃花雌蕊耐冻性能力尚鲜见报道，其内在机理更未见报道。

02研究问题

人们对ALA是否能够缓解花期低温对桃花雌蕊的伤害及其分子机制尚不知晓。本研究以‘中油4号’油桃离体花枝为试材，筛选出受ALA调控的参与桃雌蕊低温响应的关键基因PpWRKY18，并验证其生理功能，还寻找到其上游转录因子PpC3H37，探究了ALA缓解桃花雌蕊冻害的分子机理，旨在为果园预防倒春寒、保花保果进而提高桃树产量提供理论依据和关键技术。

03研究结果

（1）以‘中油4号’油桃花枝为材料，研究发现，−3 ℃低温6小时处理后花朵尤其是雌蕊受到严重冻害，雌蕊呈水渍状，褐化，无生命迹象。如果提前一周用外源ALA预处理花枝，则桃花雌蕊受冻害程度明显更轻（Fig. 1, A-C）。ALA处理可以提高低温胁迫下桃花雌蕊抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，降低活性氧积累，维持细胞膜结构完整性，进而提升雌蕊低冻性（Fig. 1, C-E）。RT-qPCR结果显示，抗氧化酶基因（PpFeSOD3、PpPOD10/16/25/31/41、PpCAT和PpCAT-L），脯氨酸合成基因（PpP5CS1）与植物冷调节基因（PpCOR1）的表达均响应低温刺激，而ALA进一步促进这些基因上调表达（Fig. 1, F）。

Fig. 1 Exogenous ALA improves freezing hardiness of nectarine flowers

（2）通过RNA-seq分析和RT-qPCR检测，我们筛选到一个响应低温和ALA处理的关键转录因子PpWRKY18（Fig. 2）。组织特异性表达分析显示，PpWRKY18在桃花雌蕊和雄蕊中表达水平最高（Fig. 2, C）。GUS与RT-qPCR检测显示，PpWRKY18启动子活性受到低温和ALA刺激，GUS基因表达水平显著增加（Fig. 2, B, D）。

（3）在烟草中异源过表达（OE）-PpWRKY18能够显著缓解低温对植株的伤害，ALA处理可以显著提升低温下烟草相关同源基因表达水平，提高植株抗氧化酶活性与渗透调节物质含量，减少活性氧和丙二醛的积累，增强转基因烟草的抗冻能力（Fig. 3），说明这是一个受ALA调控的能提高植物抗冻性的重要转录因子。

Fig. 3 Overexpression of PpWRKY18 enhances freezing hardiness of the transgenic tobacco plants

（4）研究发现，冷响应CBF通路的核心基因PpCBF1受到低温与ALA的诱导（Fig. 4, A）。Y2H、BiFC、LCI和Pulldown等试验证实，PpWRKY18和PpCBF1在蛋白质水平上存在互作（Fig. 4, B-E）。Y1H试验表明，PpCBF1作为转录因子靶向结合PpP5CS1和PpCOR1启动子，调控两个抗冻功能基因表达（Fig. 4, F）。

Fig. 4 Identification of the interaction between PpWRKY18 and PpCBF1

（5）通过Y1H、EMSA和DLR试验，我们发现，PpWRKY18能特异性结合到PpPOD41启动子上的W-box，正向激活该基因表达（Fig. 5）。这为ALA诱导桃花雌蕊氧化平衡提供了分子依据。

Fig. 5 PpWRKY18 binds to the promoter of PpPOD41 to transcriptionally activate the gene expression

（6）在PpWRKY18 调控的上游，我们以proPpWRKY18为诱饵，通过酵母核文库筛选，发现一个锌指蛋白转录因子PpC3H37（Fig. 6）。RT-qPCR与GUS结果显示，proPpC3H37受低温和ALA正调控（Fig. 6, A, B）。Y1H、EMSA和DLR证明，PpC3H37可以结合proPpWRKY18并正向调节其表达（Fig. 6, D-H）。

Fig. 6 PpC3H37 as a transcription factor, binds to the promoter of PpWRKY18 and activates its expression

04.意义和创新

花朵是果树产量基础，花冻则产量受损。本研究将ALA运用于防止桃树倒春寒危害，并且证明，提前一周基部处理，ALA可以通过木质部运输到雌蕊，缓解-3℃低温6小时胁迫伤害，揭示出响应低温和ALA的关键转录因子PpC3H37和PpWRKY18，提出以PpC3H37-PpWRKY18模块为核心的介导ALA增强桃雌蕊抗冻性的转录调控网络，为阐明ALA提高植物抗冻性机理提供了科学依据，为ALA在果树早春防寒、盛花后疏花以及保果提质中的应用提供了理论依据。

论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014124002474